Мутации гена, кодирующего определенный компонент теломеразного комплекса, приводят к развитию аутосомно-доминантной формы врожденного дискератоза, одного из наиболее распространенных видов врожденной апластической анемии Теломеры – это структурные элементы, которые «запечатывают» концы хромосом, предохраняя их от рекомбинации, слияния и ошибочного распознавания, как якобы поврежденной ДНК. Теломеразный рибонуклеопротеиновый комплекс нужен для того, чтобы поддерживать целостность теломеров. Он состоит из TERT (telomerase reverse transcriptase - теломеразной обратной транскриптазы) и соответствующей РНК, кодируемой геном TERC. При аутосомно-доминантной форме врожденного дискератоза клетки имеют значительно укороченные теломеры и низкую активность теломеразы. При данной патологии выявляются мутации гена TERC. Короткие теломеры найдены и в лейкоцитах примерно одной трети больных с приобретенной апластической анемией, особенно при резистентности к иммуносупрессивной терапии. Однако мутации TERC при приобретенной апластической анемии редки. Авторы настоящей работы предположили, что у таких больных могут обнаружиться мутации других генов, отвечающих за формирование теломеразного рибонуклеопротеинового комплекса. Методы и ход исследования. Образцы крови и клетки косного мозга брались у 200 больных с приобретенной апластической анемией, диагноз у которых ставился согласно критериям Международного исследования агранулоцитоза и апластической анемии. Носители мутации TERC были исключены из анализа. В качестве контроля использовали образцы крови 528 здоровых людей. Для изучения мутаций генов DKC1, NOP10, NHP2 и TERT, кодирующих теломеразный комплекс, применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Продукты ПЦР очищались с помощью набора QIAquick PCR purification kit (Quiagen), после чего проводили прямое определение последовательностей в генах с помощью BigDye Terminator версии 3,1 (Applied Biosystems). Для выявления микроделеций и микроинсерций продукты ПЦР непосредственно вводились в вектор pCR2,1-TOPO и переносились в особый штамм Escherichia coli (TOP10F’) с помощью клонирующего набора TOPO TA (Invitrogen). Среднюю длину теломерных повторений на концах хромосом определяли посредством гибридизации in situ с проточной флюоресценцией. Теломеразная активность активированных Т-клеток оценивалась с помощью набора выявления теломеразы TRAPeze (Chemicon) в клетках больных и их родственников с мутациями в кодоне 202 или 1090. Мутации вводились в плазмид pcI-TERT посредством набора направленного на сайт мутагенеза QuikChange (Stratagene) и проверялись с помощью определения последовательности ДНК. В периферической крови носителей мутаций и здоровых людей определяли число гематопоэтических предшественников среди мононуклеаров с помощью рекомбинантных цитокинов (StemCell Technologies) в метил-целлюлозной среде. Результаты. У 7 из 200 больных обнаружены несинонимные мутации (то есть, мутации, которые вводят изменение аминокислоты в соответствующем белке) в гене TERT. Все эти мутации были гетерозиготные (всего 5 видов мутаций), в том числе у трех из 7 пациентов – и в клетках слизистой полости рта. Ни у кого из этих больных или членов их семей при физикальном обследовании не обнаруживались признаки врожденного дискератоза. Клетки костного мозга всех пациентов с мутациями TERT имели нормальный кариотип. Детальный сбор анамнеза выявил нарушения гемопоэза у родственников 4 их 7 этих больных (миелодиспластический синдром, в одном случае перешедший в острый миелобластный лейкоз и анемия). У всех этих 7 больных теломеры в лейкоцитах периферической крови были существенно короче, чем в контрольной группе. Тест с коэкспрессией дикого типа TERT и мутировавшего TERT при апластической анемии показал, что механизм, лежащий в основе укорочения теломеразы при этих мутациях – это гапло-недостаточность (haploinsufficienly), то есть, оставшийся нормальный аллель не способен продуцировать нормальные количества фермента. Активность теломеразы в мононуклеарах больных с мутациями TERT (мутации кодонов Ala/Thr и 1090 Val/Met) была снижена приблизительно на 50% по сравнению со здоровыми - нелеченными людьми из контрольной группы. Число клеток-гематопоэтических предшественников в периферической крови у носителей мутаций TERT было существенно меньшим, чем у больных-неносителей или у здоровых (число колоний, соответственно, 41±9, 116±45 и 118±30). Ни у кого из больных с мутациями TERT не отмечено эффекта иммуносупрессивной терапии. Выводы. Мутации TERT, обнаруженные у больных с приобретенной апластической анемией, являются функционально важными, поскольку приводят к недостаточности теломеразного комплекса в клетках. Источник. H. Yamaguchi et al. Mutations in TERT, the gene for telomerase reverse transcriptase, in aplastic anemia. N Engl J Med. Apr. 7, 2005;352:1413-24. |